Фрэнк Романски1, Сандра Крёлл1, Йохан Филип Хебештрайт1, Тоня Джексон2
1 BASF SE, Людвигсхафен (Германия)
2 BASF Corporation, Флорхам Парк, Нью-Джерси (США)
В последние годы полоксамеру 188 – неионогенному полимерному поверхностно-активному ве ществу (ПАВ) и широко применяемому фармацевтическому вспомогательному веществу, стали уделять повышенное внимание в связи с его важнейшей ролью в биотехнологическом производстве клеточных культур [1]. Данный ин гредиент традиционно используют в фармацевтической отрасли в качестве солюбилизатора, увлажняющего агента, гелеобразующей матрицы, коллоидного стабилизатора и эмульгатора [1]. При традиционном применении в качестве фармацевтического вспомогательного вещества незначительные изменения от партии к партии и наличие следовых примесей, как правило, не оказывают существенного влияния на его свойства. Однако дело обстоит иначе в случае биотехнологического производства. Так, установлено, что коммерчески доступные формы полоксамера 188 очень отличаются друг от друга, что, в свою очередь, значительно сказывается на жизнеспособности клеток [2 –4]. Как следствие, для надежной оценки эффективности применения в биотехнологическом производстве одного лишь соответствия критериям официальных фармацевтических монографий недостаточно. Невзирая на изменчивость свойств и эффективности полоксамера 188, существует длинный список публикаций о его применении в производстве клеточных культур [5, 6].
Механизм, лежащий в основе защиты от сдвиговых напряжений
Положительный эффект полоксамера 188 в биологическом производстве клеток млекопитающих был впервые доказан в 90-х годах прошлого столетия в отношении клеток яичников китайского хомячка (CHO) [5, 6]. Несмотря на применение, как правило, в низких концентрациях (примерно 0,1 – 0,5% масса/масса), сегодня широко признана важность воздействия данного ПАВ на жизнеспособность клеток благодаря механизму защиты от сдвиговых напряжений. Один из потенциаль ных механизмов данного явления представлен на рис. 1.
На диаграмме отмечены некоторые из характерных участков типичного биореактора, особенно подверженные возникновению локальных усилий сдвига на контактирующих поверхностях (например, в случае с клеткой на поверхности пузырька, где жидкость граничит с воздухом). При всплывании пузырька к пенному слою на поверхности биореактора, где он лопается, возникающие локальные механические стрессы могут вызвать лизис клетки [4]. Предполагается, что добавление достаточного количества полоксамера 188 предотвращает указанное явление благодаря избирательной адсорбции, обусловленной высокой коллоидной схожестью, к поверхности контакта между клеткой и средой. Данное сильное взаимодействие приводит к образованию псевдопокрытия на поверхности между клеткой и средой с последующей минимизацией ущерба, вызванного локальными напряжениями сдвига, и поддержанием высокой жизнеспособности клеток в процессе биотехнологического производства [3, 4].
Понимание физико-химических характеристик ПАВ
Коллоидную систему определяют как многофазную систему, содержащую по крайней мере одно ПАВ, стабилизирующее дисперсную систему. Как правило, незначительные изменения в содержании следовых примесей не оказывают существенного воздействия, поскольку состав ПАВ обычно не ограничен одним видом молекул, а зачастую представлен смесью веществ с широким спектром молекулярных масс, димеров, тримеров и следовых продуктов синтеза (во многих случаях получаемых из продуктов природного происхождения с естественной изменчивостью) [7]. Полоксамер 188 представляет собой неионогенное ПАВ, получаемое путем анионной полимеризации пропилена оксида с этилена оксидом; это приводит к образованию молекул с единым центральным гидрофобным блоком (ППО), к которому примыкают два хвостовых гидрофильных блока (ПЭО). В результате данное вспомогательное вещество имеет номинальный уровень изменчивости. Полоксамер 188 производится в соответствии с требованиями фармацевтических монографий и обладает физико-химическими характеристиками, указанными в таблице 1 [4].
Следует отметить, что указанная в таблице молекулярная масса полимера ссылается на одиночное значение, полученное из гидроксильного числа. Полоксамер, однако, характеризуется широким спектром молекулярных масс, лучше представленных данными эксклюзионной хроматограммы (рис. 2).
Полоксамеры проявляют интересные физико-химические свойства в водных растворах. В частно сти, они быстро растворяются в холодной воде, обладают низкой вязкостью и ньютоновским реологическим поведением. Однако повышение температуры приводит к образованию мицелл, упорядоченных мицеллярных структур или даже термореверсивных гелей в зависимости от температуры и/или концентрации [8]. Данный механизм изображен на рис. 3.
Эти уникальные свойства дают возможность изучить сложное поведение полоксамеров в водной среде.
Гидрофобные примеси как причина изменчивости свойств и эффективности P188 и необходимость в использовании специальных методов выявления.
По данным недавно опубликованного научного сотрудничества установлено, что наличие следовых количеств гидрофобных примесей оказывает значительное влияние на жизнеспособность клеток [3, 4]. Это объясняется тем, что гидрофобные примеси приводят к нарушению механизма, лежащего в основе защиты от сдвиговых напряжений. Также доказано, что гидрофобные примеси могут быть обнаружены с помощью обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). На рис. 4 представлено сравнение стандартной изменчивости полоксамера 188 с продуктом Kolliphor® P188 Bio, специально разработанного для клеточных культур. В последнем случае оче- видно отсутствие гидрофобных примесей [3, 4].
В то время как влияние гидрофобных примесей на культивирование клеток очевидно, нет достаточно полного представления о причине столь незначительного воздействия примесей на физико-химические свойства материала. В данном исследовании представлены результаты оценки влияния следовых и более значительных количеств гидрофобных примесей на коллоидные и физико-химические свойства материала.
Влияние примесей на физико-химические свойства P188
Согласно недавним публикациям, применение статических методов определения поверхностного натяжения способно дать представление о незначительных изменениях в содержании гидрофобных примесей [9]. В частности, было доказано, что высокоочищенный полоксамер 188 обладает наиболее высоким статическим поверхностным натяжением, и добавление гидрофобных примесей приводит к общему снижению натяжения. Подобный эксперимент был проведен с применением Kolliphor® P188 Bio и измерением статического поверхностного натяжения при добавлении возрастающего количества гидрофобных примесей (рис. 6). В данной серии экспериментов использовали исходный раствор полоксамера 188 в концентрации 0,1% масса/масса, к которому добавляли гидрофобные примеси в различных массовых долях; каждый раствор затем раз бавляли в 50 мл сверхчистой воды MilliQ, после чего статическое поверхностное натяжение измеряли в зависимости от концентрации.
В случае раствора полоксамера в концентрации 0,1% очевидно, что различия между поверхностным натяжением растворов с разным содержанием примесей не столь существенны. Кроме того, поверхностное натяжение раство ра чистого полоксамера 188 не является самым высоким, но оно возрастает при повышении концентрации гидрофобных примесей при низких концентрациях полимера. При повышении концентрации полимера наблюдается инверсия тенденции с точкой пересечения при концентрации, равной приблизительно 50 мг/л. Измерения были повторно проведены с использованием исходного раствора в более высокой концентрации (1% масса/масса). Результаты представлены на рис. 7.
При начальной концентрации 1% масса/масса становится более очевидно, что чистый раствор полоксамера 188 не обладает наиболее высоким поверхностным натяжением. Следовые и более значительные количества гидрофобных примесей повышают поверхностное натяжение при низкой концентрации раствора, в то время как при более высоких концентрациях наблюдается обратная тенденция. Одним из возможных объяснений этого может быть то, что при низких концентрациях раствора при наличии гидрофобных веществ раствор менее насыщен на поверхности, контактирующей с воздухом, в результате чего наблюдается более высокое поверхностное натяжение. Парадоксальным представляется тот факт, что раствор чистого гидрофобного вещества проявляет явно более низкое поверхностное натяжение во всем диапазоне испытания.
В попытке разъяснить, имеет ли место коллоидное или физическое сцепление гидрофобных структур с полоксамером 188, был проведен ряд измерений ми целл с использованием одной из известных гидрофобных примесей. Результаты, представленные на рис. 8, отображают данные фотонной корреляционной спектроскопии неразбавленного образца с различными отношениями концентрации полоксамера 188 к концентрации гидрофобной примеси.
Результаты данных измерений свидетельствуют о том, что гидрофобные вещества в низких концентрациях не приводят к образованию смешанных мицелл, а, ско рее, обособленных, более крупных мицелл в пределах 20 – 30 нм, отличающихся от мицелл полоксамера 188, размеры которых в основном менее 10 нм. Полученные результаты были дополнены измерениями при более высоких концентрациях гидрофобной примеси (рис. 9).
Вновь очевидно образование обособленных мицелл вместо смешанных; это различие имеет важное значение, поскольку одним из возможных объяснений причины нарушения защитного механизма могло быть вмешательство гидрофобных структур в поведение и стабилизирующее действие полоксамера 188. Однако результаты тестирования подтверждают, что гидрофобные структуры не оказывают прямого воздействия на коллоидное поведение полоксамера 188, а, скорее, образуют обособленный конкурирующий комплекс. Это также свидетельствует о том, что собственно механизм взаимодействия с клетками состоит во вмешательстве посредством «модели замещения», заключающейся в предпочтительном взаимодействии гидрофобных структур с поверхностями раздела между жидкой средой и воздухом (рис. 6 и 7) и жид кой средой и клеткой (рис. 8 и 9). В результате псевдопокрытие из полоксамера 188 вокруг клеток млекопитающих замещается примесями, что приводит к снижению защиты от сдвиговых напряжений (рис. 1).
Для изучения эффектов полоксамеров в растворах был также проведен термический анализ с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Например, при высоких концентрациях полоксамеров (10 – 20% масса/масса) наблюдается реверсивное гелеобразование, что подтверждает наличие ряда фазовых переходов при ДСК-анализе. При повышении температуры чистого раствора наблюдается образование упорядоченной мицеллярной системы, сопровождающееся потреблением энергии; затем происходит гелеобразование, которому соответствует небольшой и часто малозаметный пик. Для углубления понимания указанного поведения результаты ДСК-измерений при скорости нагрева 5 К/мин [10] приведены на рис. 10.
При достижении температуры выше 35 °C потребление энергии вызвано образованием упорядоченной мицеллярной системы [10]. Вскоре после этого при температуре приблизительно 40 °C полоксамер 188 образует гель путем незначительного перехода с минимальной, практически незаметной затратой энергии. По данным диаграммы видно, что наличие гидрофобных примесей не нарушает гелеобразующее поведение и, кроме того, наблюдается появление второго пика в результате образования дополнительных мицеллярных структур (как показано на предыдущих диаграммах). На основании этого можно сделать вывод о том, что гидрофобные примеси действуют как самостоятельные структуры в среде клеточной культуры. Таким образом, нарушение механизма защиты от сдвиговых напряжений возникает в результате более высокого сходства гидрофобных примесей к поверхности раздела между жидкой средой и воздухом и между жидкой средой и клетками, что делает клетки более уязвимыми к местным высоким сдвиговым напряжениям и после дующему лизису.
Заключение
- Следовые количества гидрофобных примесей в составе полоксамера 188 могут оказывать значительное негативное влияние на его защитное воздействие от сдвиговых напряжений в биотехнологическом производстве – применение Kolliphor® P188 Bio позволяет избежать указанного риска.
- Статическое поверхностное натяжение раствора полоксамера 188 зависит от наличия гидрофобных примесей. На данное явление влияет как концентрация полоксамера, так и отношение количества примесей к содержанию полоксамера
- Гидрофобные примеси не при водят к образованию смешанных мицелл; наоборот, они действуют независимо, образуя собственные самоагрегирующиеся структуры, что доказано данными анализов ДСК и гелеобразования.
- Как свидетельствуют приведенные в данном исследовании результаты, причиной низкой эффективности типа полоксамера 188, неприемлемого для клеточных культур, является предпочтительная адсорбция гидрофобных примесей на границах раздела между жидкой средой и воздухом и между жидкой средой и клетками с последующим нарушением структуры псевдопокрытия и механизма защиты полоксамера 188 от сдвиговых напряжений.
- В качестве гидрофобных примесей могут выступать любые ПАВ, способные адсорбироваться на поверхности раздела фаз (клетки жидкой среды и/или жидкой среды-воздуха) более успешно, чем полоксамер 188. Гидрофобные примеси не взаимодействуют и не влияют на специфические физико-химические свойства полоксамера 188.
Больше информации представлено на сайте - www.pharma.basf.com
По вопросам сотрудничества
или технологической поддержки в России и СНГ
просим обращаться по телефону:
+7 (495) 231–72–00,
По вопросам сотрудничества в Украине
просим обращаться к ООО ТК «АВРОРА»:
Украина, 04112, г. Киев, ул. Дегтяревская, 62
Тел./факс: +380 (44) 594–87–77
