На біотехнологічних виробництвах, де основою технології є культивування бактерій у промислових масштабах, існує проблема контамінації бактеріофагами. Причиною цього може бути безліч факторів, тому встановити джерело контамінації майже неможливо. Одним із заходів убезпечення процесу мікробного біосинтезу від контамінації є регулярний моніторинг наявності вірусу.
Я.О. Мельничук, ПрАТ «Індар», Київ, ymelnychuk12@gmail.com
М.А. Згатогурська, Відділ молекулярної генетики бактеріофагів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ; Postdoc, Laboratory of structuralbiology, Central European InstituteofTechnology, Masaryk University(CEITEC MU), Brno, Czech Republic
Ми пропонуємо проводити моніторинг як культуральної рідини після закінчення процесу ферментації, так і приміщень, оскільки бактеріофагам властиво виживати в несприятливих умовах навколишнього середовища, а тому існує висока вірогідність їхнього накопичення на поверхнях у зоні виробництва. Найдоступнішим і найнадійнішим показником фаголізису є біологічний метод, тобто його виділення і повторне зараження носія в лабораторії. Для цього ми використовуємо класичний метод двошарового агару Міллера.
Процедура виявлення фага у приміщеннях є близькою до перевірки мікробіологічної чистоти, за винятком деяких моментів. Передусім необхідно визначити критичні точки для моніторингу. Для кожного виробництва вони індивідуальні, проте особливу увагу варто звернути на ті місця (дверні ручки, шафи для одягу, панелі управління тощо), з якими часто контактує персонал. Залежно від циклів виробництва важливо встановити частоту проведення змивів. Одним зі значущих аспектів якісно проведеного моніторингу є правильно підібрані матеріали і обладнання. Змиви доцільно проводити одноразовими стерильними свабами, виготовленими із синтетичного матеріалу, а для зберігання фагів користуватися STM-буфером, до складу якого входять 200 мМNaCl, 10 мМ TrisHCl та 10 мМMgSO4(рН 7,5). На цьому етапі варто зауважити, що саме наявність магнію є вирішальною для збереження здатності фагів до адсорбції на поверхні клітини, а склад буфера в цілому забезпечує оптимальний рН, іонну силу і стабілізує макромолекулярні структури вірусу.
Після відбору проб (змивів і культуральної рідини) ми обробляли їх хлороформом і освітлювали за допомогою низькошвидкісного центрифугування, щоб позбутися наявних бактерій. Далі супернатанти висівали на бактеріальні газони методом «спот-тесту» для первинної оцінки результатів. Після інкубування проводили облік результатів: якщо в місцях розкрапування сформувалися бляшки, то в пробі був наявний біологічно активний фаг, а якщо газон залишився неушкодженим, то робили висновок про відсутність фага. Проте у випадку відбору змивів характерним є надзвичайно низький титр фагів. Для точнішого та вірогіднішого визначення наявності бактеріофагів радимо проводити накопичення (збагачення) культури фагів. Якщо результат інкубування змиву на бактеріальному газоні свідчить про відсутність бактеріофага, тоді рекомендуємо додати до буфера і свабу зі змивом рівну частину культуральної рідини в експоненціальній фазі росту і проінкубувати протягом доби. За таких умов наявні бактеріофаги адсорбуються на клітини бактерій і розмножаться до такої кількості, за якої стане можливою детекція. Після інкубації потрібно знову очистити зразок за допомогою інкубування з хлороформом і висіяти за методом «спот-тест». Отже, у разі правильного вибору контрольних точок моніторинг дасть можливість вчасно виявити наявність бактеріофага в зоні виробництва, а також, за умови регулярного та послідовного відслідковування, допоможе встановити шляхи його потрапляння на підприємство і способи поширення приміщеннями. Також із метою оптимізації процесу та розроблення СОПів для надзвичайних ситуацій (в цьому випадку — фагових контамінацій) нами було випробувано і перевірено дезінфекційні засоби з різними активними компонентами. Це дало можливість сформувати перелік ефективних засобів для елімінації бактеріофагів на виробництві.
