A rapid identification method for pharmaceutical microbiology with MALDI Biotyper®

Olaf Degen,
менеджер з розвитку глобального бізнесу харчової
та сільськогосподарської мікробіології,
Bruker Microbiology & Infection Diagnostics

Вступ

Мікробіологічна якість лікарських засобів впливає як на ефектив­ність лікування, так і на безпеку пацієнтів. Мікробне забруднення здатне спричинити миттєві або довгострокові несприятливі наслідки на захворюваність і смерт­ність. Крім того, мікроби можуть змінювати хімічні та фармаколо­гічні властивості лікарських засо­бів, що негативно впливає на їхню ефективність через розпад актив­них інгредієнтів, а також на безпе­ку внаслідок токсичності потенцій­них продуктів розпаду.

Виявлення мікробного забруд­нення має важливе значення для фармацевтичних виробників, які керують контрольованим середо­вищем. Створення програми для моніторингу навколишнього сере­довища, за допомогою якої визна­чають ефективність гігієнічних практик, є ключовим фактором на виробництві. Така програма надає інформацію для відстеження заб­руднення через інгредієнти або біо плівки у водопроводі, щоб запо­бігти можливому мікробному за­брудненню фармацевтичної про­дукції. Це також відповідає норма­тивним вимогам.

Протягом останнього десятиліт­тя значного прогресу в мікробіоло­гічних методах було досягнуто зав­дяки постійним інноваціям у мас­спектрометрії (МС). На сьогодні стандартом в ідентифікації мікро­організмів є МС з матричною ла­зерною десорбцією/іонізацією з часовим прольотом (MALDI­-TOF MS), що дозволяє спеціалістам мі­кробіологічних лабораторій надій­но, швидко та економічно ефектив­но ідентифікувати мікроби почина­ючи з колоніального матеріалу.

MALDI-TOF MS для ідентифікації мікроорганізмів

Останніми роками MALDI-­TOF MS стала надійним інструментом для ідентифікації мікробів та виконан­ня аналізу в лабораторіях. Під час MALDI­-TOF MS мікроби ідентифіку­ють за допомогою свіжого клітин­ного матеріалу з неселективних чи селективних агарових пластин або клітинних екстрактів. Процес є швидким, чутливим і економічним з точки зору трудовитрат і вартості.

Цю технологію мікробіологи прийняли з ентузіазмом. Вони по­слуговуються MALDI­-TOF MS для ідентифікації та підтвердження мі­кробів, проведення епідеміологіч­них досліджень, ідентифікації високо патогенних мікроорганізмів, патогенних мікроорганізмів, що пе­редаються через воду та харчові продукти, а також мікробіоти шкіри.

Рішення Bruker MALDI Biotyper^® Компанія Bruker успішно предста­вила метод ідентифікації на основі молекулярної МС, який забезпечує більш швидкий і ефективніший аналіз, ніж звичайні аналізи або метод секвенування.

MALDI Biotyper^® (MBT) – це сис­тема для ідентифікації мікроорга­нізмів, яка дозволяє проводити неупереджену оцінку мікроорга­нізмів аж до видового рівня протя­гом декількох хвилин починаючи з культури. Це проста, швидка, на­дійна, високопродуктивна, еконо­мічна і ефективна технологія іден­тифікації, що ідеально підходить для застосування в мікробіологіч­них лабораторіях.

Визначаючи унікальний про­теомний відбиток організму і зі­ставляючи цей характерний па­терн з великою довідковою бібліотекою, MBT може надійно ідентифікувати невідомий мікро­організм. Бібліотека MALDI Biotyper^® наразі охоплює близько 4700 видів (версія 2022 р.), вклю­чаючи поширені в навколишньому середовищі види, а також рідкісні мікроорганізми. Постійне розширення довідкової бібліотеки гаран­тує, що широкий спектр мікроорга­нізмів можна легко ідентифікува­ти. Крім того, концепція відкритого програмного забезпечення Bruker дозволяє створювати власну бібліотеку, специфічну для кон­кретного об’єкта, яка може бути обрана разом з еталонною бібліо­текою Bruker для зіставлення з не­відомим спектром.

Оцінка ефективності

Великий фармацевтичний вироб­ник провів мікробіологічну ідентифі­кацію зразків, отриманих в резуль­таті моніторингу навколишнього се­редовища, води і виробничих опера­торів, а також виконав у лабораторії скринінгові аналізи інгредієнтів і го­тової продукції, щоб оцінити точ­ність, специфічність, прецизійність і відтворюваність MBT Bruker для зразків бактерій, дріжджів і плісняви. Додаткове тестування прово­дили з метою оцінки надійності MBT на зразках плісняви.

Фахівці лабораторії розробили протокол кваліфікації роботи з ураху­ванням досвіду мікробіологічних лабораторій на інших міжнародних майданчиках компанії. В главі 1113 Фармакопеї США (USP) наведено різні варіанти кваліфікації ефективності:

1. Використання існуючої системи для паралельного тестування ізо­лятів мікроорганізмів, отриманих в результаті рутинного тесту­вання (кількість протестованих ізолятів може досягати 50, а будь­які розбіжності в ідентифікації можна вирішити за допомогою референтного зразка).
2. Тестування 12 – 15 відомих репрезентативних вихідних культур часто різних ізольованих видів (загалом 50 тестів).
3. Підтвердження того, що 20 – 50 ідентифікацій організмів, у тому числі 15 – 20 різних видів, збігаються з результатами тесту, про­веденого у референтній лабораторії.

Протокол для бактерій і дріжджів Було проаналізовано дев’ять різ­них типів мікроорганізмів пере­важно екологічного походження (бактерії та дріжджі) (табл. 1). Ко­жен мікроорганізм оцінювали за такими параметрами:

• точність і специфічність;
• подвійна ідентифікація з МВТ, порівняння результатів з дани­ми референтного методу;
• прецизійність. Один ізолят з навколишнього середовища ідентифікували десять разів у двох екземплярах, щоб визна­чити кількість разів правильної ідентифікації;
• відтворюваність. Три аналітики виконували аналізи дев’яти мікроорганізмів протягом трьох різних днів, щоб визначити їхню відтворюваність.

Протокол для плісняви

Було проаналізовано п’ять різних типів цвілевих грибів – чотири з навколишнього середовища та один штам з Американської колек­ції типових культур (ATCC) (табл. 2). Кожен мікроорганізм оцінювали за такими параметрами:

• точність і специфічність/прецизійність/відтворюваність. Аналізи п’яти пліснявих форм були проведені, як описано вище для бактерій і дріжджів;
• надійність. Ідентифікацію­  MBT проводили та порівнюва­ли з результатами референт­них методів, якими послугову­вались для ідентифікації пліс­нявих грибів. Для цього використовували дві різні партії рідкого середовища TSB, а також одну партію HCCA­-матриці, з якої набирали дві пробір­ки; одна пробірка HCCA-­мат­риці була приготована в день аналізу, інша – за 8 днів до аналізу (а отже, була простро­чена);­
• прийнятність.

Критерії точності, специфіч­ності, прецизійності та відтворю­ваності наведено в табл. 3 з урахуванням результатів ідентифікації на Bruker MALDI Biotyper®:

• Log (оцінка) між ≥2,000 та 3,000: мікроорганізм добре ідентифіковано до видового рівня.
• Log (оцінка)* між ≥1,700 та ≤1,999: мікроорганізм добре ідентифіковано до рівня роду.
• Log (оцінка) між ≥0,000 та ≤1,699: мікроорганізм не іден­тифіковано або не знайдено жодного піка.

Примітка
*У кваліфікації ефективності жовті бали приймали, якщо отриманий вид був таким самим, як і в референтному методі.

Результати

Бактерії та дріжджі

Отримано високі результати іден­тифікації МВТ. Точність і специфіч­ність забезпечили 100% правиль­ну ідентифікацію на рівні виду для всіх бактерій і дріжджів (табл. 4). Значення Log (оцінка) наведено в колонці «Оцінка».

Повторення 10 разів аналізу одного ізоляту з навколишнього середовища (Staphylococcus capitis) у двох екземплярах дало точність 100% (результати не на­ведено). Аналогічні результати отримано з метою відтворюваності для всіх бактерій і дріжджів (табл. 5); 100% правильну ідентифікацію спостерігали щодо трьох операторів.

Пліснява

Для оцінки аналізу цвілевих гри­бів також отримано високі показ­ники ідентифікації MBT. Точність і специфічність дозволили іденти­фікувати всі плісняві гриби до видового рівня, за винятком Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, який було ідентифіковано до рівня роду [діапазон значень 1,7 – 2,0] (табл. 6).

Повторення 10 разів аналізу одного ізоляту з навколишнього середовища (Alternaria alternata) в двох екземплярах дало точність 100% (результати не наведено).

Оцінка відтворюваності (табл. 7) та надійності (табл. 8) дала високі результати, за винятком Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (всі резуль­тати для A. brasiliensis мали значення log(score) >1,7). Навіть у разі ви­користання простроченої пробірки з відновленою HCCA­-матрицею результати залишалися високими.

Висновки

Впровадження MALDI Biotyper® як внутрішнього експрес­-мікробіоло­гічного методу сприяє значному зниженню вартості/ідентифікації лише до кількох євро за зразок (рисунок), що в даному випадку заощаджує близько EUR 265 тис. щорічно, виходячи з припущення про 5000 зразків на рік.

Значна економія коштів

Висока надійність, економія часу порівняно з показниками у разі застосування власних методів і простота використання MBT Bruker забезпечують значну еко­номію коштів на проведення однієї ідентифікації.

Надійність

Завдяки використанню Bruker MBT отримано надійні та правиль­ні результати ідентифікації для всіх протестованих бактерій, дріжджів і пліснявих грибів.

Економія часу

Фармацевтичні мікробіологічні лабораторії можуть отримати ви­году від економії часу, виконуючи ідентифікацію протягом декількох хвилин після дуже короткого практичного часу, використовую­чи одну систему і один робочий процес. Це дозволяє аналізувати бактерії, дріжджі і цвілеві гриби в одному тестовому циклі з мож­ливістю обробки до 96 зразків за один цикл.

Рисунок. Економічна ефективність ідентифікації за допомогою Bruker MALDI Biotyper®

Простота використання

Технічний персонал легко навча­ється робочого процесу MBT, а результати ідентифікації чітко відображаються в зручних для ін­терпретації звітах у форматі PDF. MBT не потребує застосування інших традиційних методів іден­тифікації, таких як забарвлення за Грамом або біохімічне тестування.

Підсумок

MALDI Biotyper® забезпечує точні і швидкі результати для ідентифіка­ції мікроорганізмів, дозволяючи працівникам фармацевтичних ла­бораторій швидко визначати шта­ми з навколишнього середовища, бактерії з води, а також звичайні або патогенні види бактерій та грибів.

ТОВ «СПЕКТРОЛАБ»
Україна, Київ
Тел.: +38 044 221­06­53,
+38 063 187­21­47
info@splab.com.ua
www.splab.com.ua