ТОВ «Хімлаборреактив»— лідер у постачанні лабораторного обладнання на ринку України. Компанія співпрацює з провідними світовими виробниками, гарантуючи інноваційні рішення та відповідність міжнародним стандартам. Широкий асортимент продукції, професійний сервіс та експертність фахівців компанії дозволяють надавати клієнтам кваліфіковану підтримку на всіх етапах співпраці — від вибору обладнання до його обслуговування й навчання персоналу.
Oдин із напрямів роботи компанії «Хімлаборреактив» —постачання сучасного обладнання для фармацевтичної галузі, зокрема систем аналітичного обладнання для проведення рідинної хроматографії. У сфері фармацевтичних досліджень і розробок, що стрімко розвивається, хроматографічні методи стали незамінними для аналізу й контролю якості.
Однак розділення піків хроматограми може стати серйозним викликом. Однією з найактуальніших проблем у розділенні піків хроматограми є складність аналізованихзразків, оскільки вони часто містять кілька сполук, які можуть коелюювати, що призводить до перекриття піків і суттєво ускладнюєкількісне визначення та ідентифікацію. Для ефективного розділення цих піків необхідний висококваліфікований персонал, який має спеціалізовані знання й досвід у застосуванні хроматографічних методів, і, звісно, потрібен час. Цих двох ресурсів подеколи критично не вистачає.
Коли виникає проблема з розділенням двох піків, рішенням може стати рециркуляційна хроматографія. Це цікавий метод для різноманітних застосувань, який об’єднує їх в одному спільному завданні — відокремленні важкорозділюваних речовин. Загальний принцип для всіх підходів полягає в тому, щоб перенаправляти частково розділені аналітикілька разів через колонку. Це імітує нескінченну довжину колонки. Всі ці можливості реалізовані в рідинних хроматографах від німецького виробника систем аналітичного обладнання KNAUER, ексклюзивним дистриб’ютором яких в Україні є компанія «Хімлаборреактив».
У статті розглянуто зразкову суміш двох стевіол глікозидів, але можна навести багато інших прикладів (наприклад, розділення хіральних сполук). Цей принцип також може бути використаний у препаративній хроматографії для досягнення вищої чистоти сполук, незважаючи на завантаження більшої кількості зразка порівняно з таким за однократного прогону. Загальний принцип рециркуляційної хроматографії полягає в багаторазовому перенаправленні піків, що цікавлять виробників, через колонку. Так імітується нескінченна довжина колонки, що має результатом кращу роздільну здатність цільового піка.
Розглянемо два методи рециркуляційної хроматографії для кращого розділення піків.
Класичний метод рециркуляційної хроматографії з рециркуляцією елюенту
У класичному методі перед входом насоса встановлено Т-подібний перехідник, який з’єднаний із багатопозиційним клапаном, що виконує функцію клапана фракціонування й розташований після детектора (рис. 1). Після введення зразка за допомогою двопортового шести-позиційного інжекторного клапана клапан фракціонування перемикається в положення рециркуляції. Утворюється замкнутий контур. Сполуки, що є цікавими для виробника, перенаправляються в основний потік за допомогою Т-подібного фітинга. Після проходження головного насоса вони знову розділяються у стаціонарній фазі. Цей цикл повторюється доти, доки не буде досягнуто цільової роздільної здатності або доки розширення піка не перешкоджатиме подальшій рециркуляції. Після кожного із циклів речовини виявляє детектор для оцінювання ступеня розділення. У результаті цільові речовини можуть бути зібрані за допомогою клапана фракціонування.
Рис. 1
Рис. 2
Метод рециркуляційної хроматографії з використанням крана перемикання колонок
За допомогою методу з використанням крана перемикання колонок можна уникнути перенаправлення потоку через основний насос. Це досягається завдяки використанню другої колонки ідентичних розмірів і ще одного двопозиційного шестипортового клапана (рис. 2), який виконує функцію клапана рециркуляції. Колонки з’єднані таким чином, що цільові сполуки, виходячи з першої колонки, потрапляють у другу. Перемикання клапана рециркуляції з’єднує вихід другої колонки зі входом першої.
Подібно до методу класичної рециркуляції через насос цей цикл перемикання повторюється до досягнення цільової роздільної здатності або доки розширення піка не перевищить один об’єм колонки. Час перемикання клапана рециркуляції необхідно визначити заздалегідь. Для цього виконують один цикл з однією колонкою, щоб вирахувати час утримування цільових сполук. На відміну від методу рециркуляції через насос детектор перебуває поза контуром рециркуляції, тому роздільну здатність цільової сполуки виявляють після завершення розділення. Отже, процес не можна контролювати в режимі онлайн, якщо немає другого детектора. Для фракціонування після детектора підключають багатопозиційний клапан або колектор фракцій. Рециркуляцію розчинника можна використовувати в обох методах. Тоді як метод рециркуляції через насос працює в замкнутому контурі, метод альтернативного перекачування потребує наявності клапана фракціонування й порогової функції для рециркуляції розчинника. Для порівняння ефективності обох методів рециркуляції відомий препаративний метод ВЕРХ (VFD0170 іVFD0171) для розділення ребаудіозиду А та стевіозиду був масштабований до напівпрепаративного методу.
Рис. 3
Рис. 4
Підготовка зразків
Базовий розчин, що містить 10мг/мл стевіозиду та 10 мг/млребаудіозиду А, готували з використанням ацетонітрилу/дистильованої води у співвідношенні 30:70 (об./об.) як розчинника. Основний розчин розбавляли у співвідношенні 1:50 із розчином 30:70 ацетонітрил/дистильованавода (об./об.) для досягнення цільової концентрації 0,2 мг/мл для кожної сполуки. Зразок фільтрували через RC-мембрану на0,45 мкм (регенерована целюлоза) перед інжекцією.
Результати
Результат застосування методурециркуляції зображено на рис.3. Оскільки детектор перебуває всередині замкнутого контуру, збільшити число циклів можна за одне вимірювання. Збільшення кількості циклів сприяє підвищенню роздільної здатності піків із відповідним зменшенням висоти й збільшенням ширини. Було виконано сім циклів, перш ніж розширення піка стало критичним для повторення ще одного циклу. За допомогою альтернативного методу з перемиканням колонок можна побачити, що з кожним наступним циклом роздільна здатність також підвищувалася (рис. 4). Після шести циклів було досягнуто максимально можливої роздільної здатності (1,29). Оскільки ширина піка досягає об’єму колонки, роздільна здатність не може бути підвищена. Порівняння роздільної здатності показано на рис. 5, де видно, що для максимальної роздільної здатності 1,13, досягнутої за допомогою рециркуляції, знадобилося на три цикли менше, ніж у разі перемикання колонок. Послуговуючись останнім методом, було досягнуто максимальної роздільної здатності 1,29. Як і очікувалося, площі піків для кожного циклу залишалися незмінними, тоді як ширина піків збільшувалася. Жоден зразок не був втрачений під час застосування двох різних методів перероблення (рис. 6).
Рис. 5
Рис. 6
Результати використання обох методів свідчать, що за допомогою рециркуляційної хроматографії можна проводити складні розділення.
Переваги й недоліки класичного методу
Перевага застосування методу рециркуляції через насос полягає у тому, що конфігурація приладу є досить простою. Розроблення методу не викликає труднощів, оскільки процес можна контролювати в режимі онлайн за допомогою детектора. Завдяки замкнутому циклу споживання розчинника є низьким. Основним недоліком методу рециркуляції через насос є великий «мертвий» об’єм. Будь-яка трубка, встановлена до й після колонки, головка насоса всередині або камера змішування збільшують цей об’єм, що призводить до часткового перемішування речовин після виходу зі стаціонарної фази. Як наслідок, відбувається швидке розширення піка. Іншим недоліком є те, що насос і система подавання елюенту забруднюються зразком. Залежно від призначення це може бутис ерйозним недоліком.
Переваги й недоліки методу з використанням крана перемикання колонок
Порівняно з класичним підходом до рециркуляції через насос метод із використанням крана перемикання колонок усуває деякі з недоліків, згаданих вище.
Передусім зразок ніколи не контактує безпосередньо із системою подавання елюенту, що дає змогу уникнути його забруднення. Крім того, «мертвий» об’єм значно менший, оскільки враховують тільки капіляри між входами й виходами колонки та «мертвий» об’єм клапана рециркуляції.
Отже, зі збільшенням кількості циклів розширення піка відбувається не так швидко, як за використання методу циклічного перекачування через насос. Відповідно роздільна здатність цільових піків також швидше зростає. У наведеному прикладі такої самої роздільної здатності можна досягти на трицикли раніше. Це допомагає скоротити загальний час виконання. Одним із недоліків методу почергового перекачування є необхідність у застосуванні другої колонки й клапана, що ускладнює експлуатацію приладу.
Процес складно контролювати в режимі онлайн, оскільки детектор зазвичай перебуває поза контуром рециркуляції. Проте метод альтернативного прокачування демонструє кращу роздільну здатність щодо цільових речовин і тому є більш придатним для розділення зразка.
«Хімлаборреактив» — ексклюзивний дистриб’ютор рідинних хроматографів виробництва KNAUER в Україні. Звертайтеся до фахівців компанії і разом із ХЛР та KNAUER робіть проведення хроматографічного аналізу ще зручнішим і досконалішим.
Ірина Кіріна,
керівник відділу галузевих експертів, «Хімлаборреактив»
Станіслав Сидорук,
продакт-фахівець відділу загальнолабораторного обладнання, «Хімлаборреактив»
